• Koliform Grubu Bakterilerinin Analizi

    Koliform grubu bakterilerin tayini için 2 metot kullanılmaktadır:

     

    1- Çoklu Tüp Fermantasyon Tekniği
    2- Membran Filtre Tekniği

     

    Bu metotlar aşağıda kısaca özetlenmiştir.

     

    1) Koliform Grubu Tayini İçin Çoklu Tüp Fermantasyon Tekniği

     

    Çoklu tüp fermantasyon tekniğinin ana hatları: Koliform grubu, aerobik ve fakültatif anaerobik, gram negatif, spor oluşturmayan çubuk şekilli bakterileri tanımlar. Bunlar; laktozu 48 saatte, 35 °C’de gaz çıkışı ile fermente ederler. Metot, çok sayıda tüplerde değişik seyreltmelerde incelemenin yapılması ve en muhtemel sayı (MPN)’nin bulunmasına dayandığından, bu testin hassaslığı, kullanılan tüplerin sayısına bağlıdır. Bakteri içeriğinin sayısal değeri; çok sayıda hazırlanmış, negatif ve pozitif sonuçlar gösteren tüpler yardımı ile hesaplanır ve belli bir kritik seyrelmede istenen hassas sonuç elde edilebilir. Test sonuçlarının MPN olarak ifadesinde, istatistiksel olarak değerlendirmeler yapılır. İçme suyu analizlerinde her biri 10 ml ya da 100 ml numune içeren 5 fermantasyon tüpü kullanılır. Genellikle 100 ml’den daha büyük kısımların kullanılması pratik değildir. Sık incelenen sularda, 5 adet 10 ml ya da 5 adet 100 ml’lik kısımların analizi, yeteri kadar kesin sonuç verir. Diğer içme suyu analizlerinde en az üç seyreltme ve her seyreltmede 5 tüp kullanılması tavsiye edilir.

     

    Genellikle içme sularının rutin analizlerinde içilebilirlik değerlendirmesi, bakteriyolojik kaliteye göre yapılmaktadır. Bu numunelerin % 95’inden daha fazlasında negatif sonuçlar alınacağı beklenir. Pozitif sonuç çıkarsa, aynı numune alma noktasında tekrarlanan deneylerde pozitif sonuç alınmadıkça ihmal edilebilir. Zaman içerisinde pozitif numune sayısındaki artış, su kalitesinde bozulmaya işaret eder.

     

    Çoklu tüp fermantasyon tekniğinde istatistik olarak MPN değerlerinin tahmini için her seri, minimum 3, tercihen 5 tüp içermelidir. Çoklu tüp tekniği tuzlu sulardaki analizler için de uygundur. İçme suyu amacı ile kullanılmayan sularda da bakteriyolojik kirlenmeyi bulmak üzere uygulanmaktadır. Çoklu tüp fermantasyon tekniği; tahmin testi, doğrulama testi ve tamamlama testi olmak üzere 3 kademede yapılır.

     
    Tahmin Testi

    Bu testin amacı sularda tahmin edilen kirlilik derecesine göre belirlenen numune hacminin fermantasyon tüplerine konulması ve bu tüplerde 48±3 saat içinde gaz oluşumunun incelenmesidir. Eğer fermantasyon sonucu gaz oluşursa, üreme ortamı bulanık hale gelir. Aktif fermantasyon, aşağıdan yukarı doğru sürekli gaz kabarcıklarının çıkışı ile gözlenebilir. 48±3 saat sonunda tahmin deney tüplerinde koliform bakteri üremesine kanıt olan bir gaz oluşumu yoksa, test sonucu negatiftir. Tahmin deneyi için laktoz broth veya lauryl trptose broth kullanılabilir. Pozitif sonuçlar doğrulama testi yapılmadan kullanılmamalıdır.

     
    Doğrulama Testi

    Fermantasyon için laktoz broth veya tercihen lauryl trptose broth kullanılabilir. Doğrulama testi için parlak yeşil laktoz safra broth besi yeri kullanılması tavsiye edilmektedir. Bu testin yapılmasındaki amaç, 48 saatin sonunda, tahmin testinde belirlenen gazın koliform bakteriler tarafından meydana getirilip getirilmediğinin doğrulanmasından ibarettir. 48 saat sonunda gaz üretimi görülen numunenin orijinalinden tüm tüplere çeşitli seyreltmeler yapılır. Seyreltme yapılan tüm fermantasyon tüplerinde üreme ve gaz oluşumunun varlığı kontrol edilir. 24 saatlik inkübasyon sonunda, ortamda bir gaz oluşumu varsa, doğrulama testi pozitiftir; gaz oluşumu izlenmezse test negatiftir.

     
    Tamamlama Testi

    Tamamlama testi, doğrulama testinden sonra uygulanır ve en son kademedir. İki testten olumlu sonuç alındıktan sonra, tamamlama testi yapılır. Bu amaç için parlak yeşil laktoz safra broth içeren fermantasyon tüpleri kullanılır. Gaz üretimi gözlenen tüplerin her birinde gaz çıkışı gözlenir gözlenmez, hemen numune alınarak Endo veya Eosin Metilen Mavisi içeren kaplara ekim yapılır. Kap 35±0.5 °C’de, 24±2 saat inkübe edilir. Endo veya eosin metilen mavisi agar üzerinde gelişen koloniler tipik, atipik veya negatif olarak tanımlanır. Oluşan koloniler, koloni sayıcıda belli bir büyütme altında sayılırlar. Eğer 48 saat sonunda laktozda gaz üretimi varsa ve mikroskopik inceleme, spor oluşturmayan gram negatif çubuk bakterilerin varlığını gösteriyorsa, test tamamlanmış sayılır ve koliform organizmaların varlığı kanıtlanmış olur.

     
    Testlerin Yapılışı
     

    – Tahmin testi: Her biri 10 ml lauril laktoz triptoz (LLT) broth (%4 triptoz, % 1 laktoz, %0.5 KH2PO4, % 0.5 K2HPO4, % 1 NaCl, % 0.02 sodyum laurilsülfat, pH 6.8) içeren 5 fermantasyon tüpünün her birine 10 ml seyreltilmiş su numunesi konur, 35 °C’de inkübe edilir.
    – Doğrulama testi: Sonuçlar incelendikten sonra, seyreltilmemiş numuneden en az içeren pozitif test tüpünden halka üzerine alınan kültür sıvısı, brilliant green (parlak yeşil) laktoz safra broth’u (% 1 pepton, % 1 laktoz, % 2 oksigal, % 0.00133 brilliant green) içeren tüpe aktarılır, 35°C’de inkübe edilir.
    – Tamamlama testi: Pozitif sonuç veren brilliant green safra broth’u üzerinden alınan kültür, EMB (% 1 pepton, %1 laktoz, %2 KH2PO4, % 0.04 eosin, % 0.01 metilen mavisi) içeren kaba ekim yapılır ve 35°C’de inkübe edilir.
    – EMB kaplarının incelenmesi: İnkübasyondan sonra aşağıda verilen koloni tipleri oluşabilir;

    1. Tipik: Koyu kırmızı, çekirdekli, metalik parlaklık olabilir veya olmayabilir.
    2. Atipik: Pembe, opak, çekirdeksiz
    3. Koliform olmayan: Diğerleri

     

    2) Koliform Grubu Bakterilerin Tayini İçin Membran Filtre Tekniği

     

    Koliform bakterilerin membran filtre tekniği ile tayininde, ortamda bulanıklık olmaması istenir. Bu teknik, tuzlu sularda koliform bakteri tayini için uygun olmakla beraber, ön çökeltimden geçmiş ve klorlanmış atıksularda uygulanmaz. Ayrıca membran filtre tekniğinin toksik metalleri veya fenolleri içeren atıksularda uygulanması mümkün değildir.

     

    Araç ve Gereçler

    Laboratuvarda kullanılan cam kaplar borosilikat olmalı ve kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. Gerekli malzeme ve aparatlar şunlardır:

    – Numune şişeleri
    – Seyreltme şişeleri
    – Pipetler ve mezürler
    – Kültür ortamını içeren kaplar
    – Petri kapları
    – Filtrasyon sistemi
    – Membran filtreler
    – Adsorban besi ortamları
    – Forseps
    – İnkübatör
    – Mikroskop ve ışık kaynağı

     

    Gerekli Kültür Ortamı

    Besiyeri enterobakter aerogenez kültüründen hazırlanmış seyreltmeleri ekerek kontrol edilir. Su hacmi, her membran filtre üzerinde 20-80 koloni kalacak şekilde alınarak filtreden geçirilir.

     

    Numuneler

    Numuneler iyice yıkanmış, sterilize edilmiş cam şişelere alınır. Şişe, ağzına kadar doldurulmamalı, karıştırmada kolaylık sağlaması bakımından su üzerinde boşluk bırakılmalıdır. Numune şişeleri, numune alındıktan sonra hemen kapatılıp, kirlenmeye karşı korunmalıdır. Tercihen 100 ml’den az numune alınmamalıdır. Numuneler alındıktan sonra 1 saat içinde analiz edilmeyecekse, buz kutularında saklanarak, laboratuvara getirilmelidir. 6 saatlik bir zaman periyodu için numunelerin 10 °C’de beklemesine müsaade edilir. Bu numuneler laboratuvara geldikten sonra, 2 saat içinde işlem görmelidirler. Ulaşımın 6 saatten fazla olması halinde, arazide analiz yapma yoluna gidilmelidir.

     

    Tanımlama

    24 saatlik inkübasyon periyodu sonunda, altın yeşili metalik halka oluşumu ile koloni üreten tüm organizmalar, koliform grubu bakteri olarak tanımlanırlar. İnkübasyon sıcaklığı 35±0.5°C’dir.

     

    Testin Yapılışı

    İçme sularında koliform grubu bakteri aranacağı zaman, numunenin zenginleştirilmesi gerekir. Evsel atıksular ve kirlenmiş yüzeysel sular için zenginleştirme işlemi gerekli değildir. Burada anlatılan metot için M-Endo ortamı kullanılmaktadır.

     

    Numune miktarının seçimi: Numune miktarı suda bulunduğu tahmin edilen bakteri yoğunluğuna göre seçilir (Tablo 1). En ideali, büyüme sonucu 50 koloni, en fazla 200 koloni olacak şekilde numune hacmini seçmektir. Filtrelenecek numune hacmi 100 ml veya daha az olabilmektedir.

     

    Tablo 1. Membran filtre ile toplam koliform bakteri tayini için tavsiye edilen numune hacimleri

    Filtrelenecek su hacmi, ml

    Su kaynağı 100 50 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001
    İçme suyu

    X

    Yüzme havuzu

    X

    Kuyu veya pınar suyu

    X

    X

    X

    Göl ve rezervuar

    X

    X

    X

    Su temini girişi

    X

    X

    X

    Plajlar

    X

    X

    X

    Nehirler

    X

    X

    X

    X

    Klorlanmış evsel atıksu

    X

    X

    X

    Mam evsel atıksu

    X

    X

    X

    X

     

    Numunenin Filtrasyonu ve Testin Yapılması: Steril forsepsleri kullanarak, steril filtre kağıdı, filtrasyon aparatına yerleştirilir. Üzerine dikkatlice süzme bölmesi yerleştirilir. Numune basınç altında filtrasyon cihazına verilir ve filtrelenir. Filtrasyondan önce ve sonra filtreye bir miktar destile su verilerek çalkalanır. Filtrasyon ünitesi açılarak forseps ile filtre kağıdı alınır ve steril nutrient besi ortamı (nutrient pad) veya agar üzerine yerleştirilir ve derhal kapatılır.

     

    Filtrasyon ünitesi kullanma öncesinde ultraviyole (UV) sterilizasyon cihazı, kaynar su veya alev yöntemlerinin herhangi biri ile sterilize edilmelidir. Önceden taze steril pet; petri kabına yerleştirilir ve 1.8-2 ml Endo ortamı ilave edilir. Numune filtre edildikten sonra fitre kağıdı yukarıda açıklandığı şekilde hazırlanan petri kabına konur, petri kabı kapatılır vc 24-48 saat 35±0.5 °C’de inkübatörde inkübe edilir.

     

    Savma işlemi: Koliform bakterileri, koyu pembe-kırmızı renk hakim ve etrafında metalik halka bulunan tipik kolonileri ile tanımlanırlar. Sayma işlemi düşük güçlü, tercihen (10x,15x) büyütmeli, binoküler mikroskop ile yapılır.

     

    Toplam Koliform Yoğunluğunun Hesabı: Koliform yoğunluğu, toplam koliform/100 ml şeklinde ifade edilir. Membran filtre üzerinde oluşan koloniler sayılır ve sonuç aşağıdaki formül ile ifade edilir;

     

    Toplam Koliform Kolonisi/100 ml =Sayılan Koliform Sayısı * 100 / Filtrelenen numune hacmi (ml)

Yazar

Daha yeşil ve güzel bir Dünya için yola çıkan Yeşil Aşkı, herkesi Dünya’ya zarar vermeden, çevre dostu ve sürdürülebilir bir yaşama davet ediyor. Bütün gayemiz; temiz bir çevre, yaşanabilir bir dünya ve yeşil gören gözlerdir. Yeşil görmeyen gözler, Renk zevkinden mahrumdur.
Twitter Facebook Google+ Linkedin YouTube
Önceki Yazı:Suyu Tüketiyoruz
Sonraki Yazı:Çev-Ka Danışmanlık İş İlanı

Yorumlar

Bu yazıya 2 yorum yapılmış.

  1. Buse

    Keşke kaynakça da belirtseniz.

  2. Buse Hanım, çevre analizlerine ait kaynakça standartlardır. Konuyla alakalı standart metot isimlerini TÜRKAK’ın sitesinde bulabilirsiniz. Örnek olarak TS EN ISO 9308-1 ve TS EN ISO 9308-2 standartlarını verebiliriz. Bu standartlar ücretlidir. İçeriğine ulaşmak için satın almanız gerekmektedir.

SİZ DE CEVAP YAZABİLİRSİNİZ

Bu yazı hakkında görüşünüzü belirtin.

Copyright © 2013 - 2017 • Tüm Hakları Saklıdır.